RESUMO: Campylobacter spp. é um agente bacteriano causador de gastroenterite em humanos e associado à síndrome de Guillain-Barré, sendo a campilobacteriose considerada uma das principais enfermidades de origem alimentar. Aves e suínos são importantes reservatórios desses microrganismos e seus produtos derivados crus ou mal cozidos são muitas vezes incriminados como fonte de infecção humana. A primeira escolha para o tratamento em casos humanos são os antimicrobianos da classe dos macrolídeos como à eritromicina. Dentro desse contexto, o objetivo deste estudo foi isolar Campylobacter jejuni e C. coli a partir de 20 amostras de conteúdo intestinal de frangos de corte e de 30 de suínos ao abate e investigar a resistência à eritromicina das estirpes obtidas e os possíveis mecanismos moleculares envolvidos nesta resistência. A concentração inibitória mínima foi determinada pela diluição em ágar e a técnica MAMA-PCR foi utilizada para detecção de mutações nas posições 2074 e 2075 da região 23s rRNA, foi pesquisado também a presença do gene erm(B) pela PCR. A partir do conteúdo intestinal de frangos de corte foram isoladas 18 estirpes de C. jejuni e duas de C. coli, enquanto de suínos foram obtidas 14 estirpes de C. coli e nenhuma estirpe de C. jejuni. Todas as estirpes de C. coli de suínos foram identificadas como resistentes e três estirpes de C. jejuni de frangos foram caracterizadas com resistência intermediária. A CIM das estirpes variou de ≤0,5mg/μL a ≥128mg/μL. Todas as estirpes resistentes tinham a mutação A2075G e uma cepa com resistência intermediária também apresentou a mutação A2075G. Não foi detectada a mutação A2074C ou a presença do gene erm(B) em nenhuma das estirpes obtidas. Os resultados revelam um alto nível de resistência em estirpes de C. coli isoladas de suínos frente a eritromicina. A técnica MAMA PCR utilizada se constitui em uma ferramenta prática para detecção da resistência à eritromicina em estirpes de C. jejuni e C. coli.

ABSTRACT: Campylobacter spp. is a bacterial agent that causes gastroenteritis in humans and may trigger Guillain-Barré Syndrome (GBS) and is also considered one of the main foodborne diseases in developed countries. Poultry and pigs are considered reservoirs of these microorganisms, as well as raw or undercooked by-products are often incriminated as a source of human infection. Treatment in human cases is with macrolide, such erythromycin, that inhibits the protein synthesis of the microorganism. This study aimed to isolate Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from intestinal content samples of broiler chickens (n=20) and swine (n=30) to characterize the erythromycin resistance profile of the strains and to detect molecular mechanisms involved in this resistance. The minimum inhibitory concentration was determined by agar dilution. The Mismatch Amplification Mutation Assay-Polymerase Chain Reaction (MAMA-PCR) was performed to detect mutations at positions 2074 and 2075 of 23S rRNA region, in addition to PCR test to detect the erm(B) gene. From the intestinal content of broiler chickens, 18 strains of C. jejuni and two strains of C. coli were isolated, whereas, from swine samples, no C. jejuni strain and 14 strains of C. coli were isolated. All C. coli strains were resistant, and three C. jejuni strains from broilers chickens were characterized with intermediate resistance to erythromycin. The MIC of the strains ranged from ≤0.5mg/μL to ≥128mg/μL. All resistant strains had the A2075G mutation, and one strain with intermediate resistance had the A2075G mutation. However, the A2074C mutation and the erm(B) gene were not detected. High resistance levels were detected in C. coli strains isolated from swine. The MAMA-PCR is a practical tool for detecting the erythromycin resistance in Campylobacter strains.

RESUMO: As aves são os principais reservatórios de Campylobacter spp., importante patógeno de origem alimentar e a carne de frango e produtos derivados são os principais veículos desse microrganismo. O aumento de cepas de Campylobacter spp. resistentes às fluorquinolonas, uma classe antimicrobiana frequentemente empregada na avicultura e na medicina humana, tornou-se uma grande preocupação para os produtores de aves e vários estudos avaliaram o aumento da resistência bacteriana a esses antimicrobianos. O papel do sistema de efluxo CmeABC tem sido enfatizado entre os mecanismos de resistência em Campylobacter spp. à fluorquinolonas. O presente estudo investigou a ocorrência da bomba de efluxo CmeABC em 81 cepas de Campylobacter jejuni e 78 cepas de Campylobacter coli resistentes à enrofloxacina, isoladas de frangos de corte coletados em seis abatedouros situados no polo avícola de São José do Rio Preto/RJ e de dois abatedouros comerciais situados na Região Metropolitana do Rio de Janeiro, de 2013 a 2016. A resistência à enrofloxacina foi avaliada pelo método de diluição em ágar para determinar a concentração inibitória mínima (CIM). O sistema de efluxo CmeABC foi investigado através da detecção dos genes cmeA, cmeB e cmeC por PCR. A atividade da bomba de efluxo CmeABC foi investigada em 20 cepas utilizando o inibidor da bomba de efluxo Phenylalanine-Arginine β-Naftilamida (PAβN). Os três genes cmeA, cmeB e cmeC foram detectados em 94,3% das cepas (C. jejuni = 80 e C. coli = 70), enquanto o sistema estava ausente ou incompleto em 5,7% das cepas (C. jejuni = 1 e C coli = 8). A CIM variou entre 0,5μg/ml e 64μg/ml e 88,7% das cepas foram resistentes à enrofloxacina, enquanto 11,3% apresentaram resistência intermediária. A inibição da bomba de efluxo pelo PAβN reduziu a CIM da enrofloxacina até oito vezes em quinze cepas (75%). Estes resultados indicam que este sistema é frequente e ativo em cepas resistentes de Campylobacter spp. na presença de enrofloxacina.

ABSTRACT: Fowls are the main reservoirs of the highly important food-originating pathogen called Campylobacter spp. and broilers’ meat and byproducts are the main vehicles of this microorganism. Increasing of Campylobacter spp. resistant strains to fluorquinolones, an antimicrobial class often employed in poultry farming and in human medicine has become a great concern to poultry breeders. In fact, several studies evaluated increasing bacterial resistance against these antimicrobial agents. The role of CmeABC efflux system has been underscored among the resistance mechanisms in Campylobacter spp. to fluorquinolones. This study investigated the occurrence of CmeABC efflux pump in 81 and 78 enrofloxacin resistant strains of Campylobacter jejuni and C. coli respectively, isolated from broilers collected from six abattoirs situated at São José do Vale do Rio Preto/RJ poultry center and from two commercial abattoirs situated at Metropolitan Region of Rio de Janeiro, from 2013 to 2016. The resistance to enrofloxacin was assessed by agar dilution to determine minimum inhibitory concentration (MIC). The CmeABC efflux system was investigated through the detection of genes genes cmeA, cmeB and cmeC by PCR. The activity of CmeABC efflux pump was investigated in 20 strains by using the efflux pump inhibitor Phenylalanine-Arginine β-Naphthylamide (PAβN). The three genes cmeA, cmeB and cmeC were detected in 94.3% of the strains (C. jejuni = 80 and C. coli = 70), whereas the system was absent or incomplete in 5.7% of strains (C. jejuni = 1 and C. coli = 8). MIC varied between 0.5μg/ml and 64μg/ml, and 88.7% of strains were enrofloxacin resistant and 11.3% featuring intermediate resistance. The inhibition of the efflux pump by PAβN reduced the MIC to enrofloxacin up to eight times in fifteen strains (75%). These results indicate that this system is frequent and active in Campylobacter spp. Resistant strains in the presence of enrofloxacin.

RESUMO: A presença de Salmonella spp. em produtos de origem avícola e seus subprodutos se mostra um grande desafio para a produção comercial. Dados de prevalência, dos sorotipos circulantes e do perfil de susceptibilidade antimicrobiana de cepas de Salmonella spp. no Estado do Rio de Janeiro são escassos. Portanto, objetivou-se detectar a presença Salmonella spp. em frangos vivos e carcaças em matadouros do Estados do Rio de Janeiro, identificar os sorotipos e avaliar a susceptibilidade antimicrobiana dessas cepas para fluoroquinolonas e betalactâmicos. Foram coletadas 60 amostras cloacais de frangos vivos e 60 amostras de carcaça de seis matadouros sob Inspeção Estadual (SIE). Os isolados foram sorotipificados e testados frente a oito antimicrobianos: enrofloxacina, ciprofloxacina, norfloxacina, cefalotina, ceftiofur, cefotaxima, amoxicilina/ácido clavulânico e ampicilina pelo método de difusão em disco. Os resultados mostraram uma prevalência de Salmonella spp. de 1,66% (1/60) em amostras de suabe de cloaca e de 26,66% (16/60) em carcaças. Em amostras de suabe de cloaca, somente o sorotipo Senftenberg (1,66%) foi isolado. No total, foram isolados sete sorotipos diferentes nas carcaças: Senftenberg (15%) o mais frequente, seguido por Mbandaka (8,3%), Schwarzengrund (3,3%), Cerro (3,3%), Ohio (3,3%), Minnesota (1,66%) e Tennessee (1,66%). Em relação à susceptibilidade antimicrobiana, 29 (87,87%) isolados foram sensíveis a todos os antimicrobianos testados e 4 (12,12%) isolados foram resistentes a pelo menos três antimicrobianos betalactâmicos ou mais. Não foi observada resistência às fluoroquinolonas. Os resultados encontrados demonstram uma prevalência de Salmonella spp. acima da esperada em matadouros do Estado do Rio de Janeiro, além da presença de vários sorotipos de Salmonella spp. A resistência encontrada para betalactâmicos alerta para a disseminação dessas cepas pela cadeia alimentar.

ABSTRACT: The presence of Salmonella spp. in poultry products and their by-products is a major challenge for commercial production. Data about the prevalence, the circulating serotypes and the antimicrobial susceptibility profile of Salmonella spp. strains in the State of Rio de Janeiro are scarce. Therefore, the aim of this study was to detect the presence of Salmonella spp. in live chickens and carcasses in slaughterhouses of the State of Rio de Janeiro, to identify the serotypes and to evaluate the antimicrobial susceptibility of these strains for fluoroquinolones and beta-lactams. Sixty cloacal swabs samples from broiler chickens and sixty samples of carcasses from six slaughterhouses under State Inspection were collected. The isolates were serotyped and resistance was tested to eight antimicrobials: enrofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin, cephalothin, ceftiofur, cefotaxime, amoxicillin/clavulanic acid and ampicillin by disc diffusion method. The results showed a prevalence of Salmonella spp. of 1.66% (1/60) in cloacal swabs samples and 26.66% (16/60) in carcasses. In cloacal swabs sample only Senftenberg (1.66%) serotype was isolated. In total, seven different serotypes were obtained from carcasses: Senftenberg (15%), followed by Mbandaka (8.3%), Schwarzengrund (3.3%), Cerro (3.3%), Ohio (3.3%), Minnesota (1.66%) and Tennessee (1.66%). Regarding antimicrobial susceptibility, 29 (87.87%) isolates were sensitive to all antimicrobials tested and 4 (12.12%) isolates were resistant to three or more beta-lactams antimicrobials. No susceptibility to fluoroquinolones was observed. These results showed a prevalence of Salmonella spp. higher than expected in slaughterhouses in the State of Rio de Janeiro, besides the presence of several serotypes of Salmonella spp. The resistance found for beta-lactams alerts to the spread of these strains through the food chain.

Resumo Estudos têm revelado que a resistência às quinolonas em cepas de Campylobacter está relacionada à presença da mutação Treonina-86 para Isoleucina. Com o objetivo de investigar a presença dessa mutação em cepas de Campylobacter sensíveis e resistentes à ciprofloxacina e enrofloxacina, o conteúdo cecal de 80 frangos de corte de criação orgânica, abatidos sob Serviço de Inspeção Estadual (S.I.E.) do Estado do Rio de Janeiro, foram coletados e investigados para a presença de Campylobacter. A determinação da resistência à ciprofloxacina e enrofloxacina foi feita pela técnica de difusão em disco e de diluição em ágar para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). A detecção da mutação na Região Determinante de Resistencia às Quinolonas (RDRQ) no gene gyrA foi realizada através de sequenciamento. Campylobacter foi isolado a partir de 100% das amostras avaliadas, sendo 68,75% correspondente à C. jejuni e 31,25% à C. coli. No teste de difusão em disco, 100% das cepas foram resistentes à ciprofloxacina e 56,25% das cepas foram resistentes à enrofloxacina. No teste de diluição em ágar, todas as cepas foram resistentes à ciprofloxacina apresentando CIM variando de ≥ 16-64μg/mL, e resistência ou resistência intermediaria à enrofloxacina foi detectada em 42,50% (CIM ≥ 4-32μg/mL) e 38,75% (CIM = 2μg/mL) das cepas, respectivamente. A mutação Tre-86-Ile, foi observada em 100% das cepas analisadas. Além dessa mutação, foram observadas outras mutações não silenciosas (Val-73-Glu, Ser-114-Leu, Val-88-Asp, Ala-75-Asp, Ser-119-Gli, Arg-79-Lis) e mutações silenciosas (His-81-His, Ser-119-Ser, Ala-120-Ala, Fen-99-Fen, Ala-122-Ala, Gli-74-Gli, Ile-77-Ile, Ala-91-Ala, Leu-92-Leu, Val-93-Val, Ile-106-Ile, Tre-107-Tre, Gli-113-Gli, Ile-115-Ile, Gli-110-Gli). A observação de que cepas sensíveis à enrofloxacina pelos testes fenotípicos apresentavam a substituição Tre-86 para Ile sugere que outros mecanismos podem contribuir para a resistência à enrofloxacina em Campylobacter.

Abstract Studies have shown that resistance to quinolones in Campylobacter strains is related with Threonine-86-Isoleucine mutation. In order to investigate the presence of this mutation in sensitive and resistant Campylobacter strains to ciprofloxacin and enrofloxacin, the cecal contents of 80 broilers from organic raising chickens, slaughtered under State Inspection Service (S.I.S) of the State of Rio de Janeiro, were collected and tested for the presence of Campylobacter. The determination of ciprofloxacin and enrofloxacin susceptibility was done by disk diffusion and agar dilution methods for determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC). The detection of mutation in Quinolone Resistance Determinant Region (QRDR) in gyrA gene was done by sequencing. Campylobacter was isolated from 100% of the samples, being 68.75% C. jejuni and 31.25% C. coli. By the disk diffusion method, resistance to ciprofloxacin was observed in all isolates and 56.25% of the strains were resistant to enrofloxacin. By agar dilution method, all strains were resistant to ciprofloxacin (MIC ≥ 16μg/mL to ≥ 64μg/mL) and full and intermediate resistance to enrofloxacin was detected in 42.50% (MIC ≥ 4-32μg/mL) and 38.75% (MIC =2μg/mL) of the strains, respectively. Mutation Thr-86-Ile was observed in 100% of the isolates investigated. In addition to this mutation, others no silent mutations (Val-73-Glu, Ser-114-Leu, Val-88-Asp, Ala-75-Asp, Gly-119-Ser, Arg-79-Lys) and silent mutations (His-81-His, Ser-119-Ser, Ala-120-Ala, Phe-99-Phe, Ala-122-Ala, Gly-74-Gly, Ile-77-Ile, Ala-91-Ala, Leu-92-Leu, Val-93-Val, Ile-106-Ile, Thr-107-Thr, Gly-113-Gly, Ile-115-Ile, Gly-110-Gly) were detected. All the enrofloxacin-sensitive strains by the phenotypic methods had the Thr-86 to Ile substitution, which suggests other mechanisms contributing to enrofloxacin resistance in Campylobacter.